Jurnal Internasional Gp1ba-Cre atau Pf4-Cre: ambil racun Anda

Download Jurnal Disini

Dalam edisi Darah ini, Nagy et al mengembangkan novel Gp1ba-Cre mouse yang menggunakan lokus Gp1ba yang mengkodekan subunit glikoprotein Ibα (GPIbα) dari reseptor GPib-IX untuk mendorong ekspresi Cre dalam murine megakaryocytes (MKs) untuk target ablasi gen floxed. 1

Alasan untuk penelitian ini adalah untuk meningkatkan pada emas saat ini. standar: faktor platelet 4 (PF4) -Cre recombinase (Pf4-Cre) untuk membuat sistem KO bersyarat pada MK dan platelet. Pada mouse Pf4-Crekonstruk Cre diganti menjadi ch100-kb murine bacterial chromosome buatan (BAC) yang mengandung Cxcl4 dan beberapa CXC lainnya. gen. 2 The Pf4- Cre mouse telah banyak digunakan untuk menghasilkan model KO / KO bersyarat dengan target platelet untuk mengevaluasi mekanisme yang mendasari produksi dan fungsi trombosit, tetapi ada beberapa batasan dengan model ini, termasuk salinan tambahan dari beberapa chemokine CXC yang dapat memberikan efek proinflamasi (lihat tabel untuk plus dan minus dari 2 konstruksi). Keterbatasan lain datang dari pengakuan bahwa meskipun ekspresi PF4 mungkin tinggi selama megakaryopoiesis, itu juga hadir dalam sel-sel induk hematopoietik, dan sel-sel yang diturunkan limfoid dan myeloid, terutama di negara-negara inflamasi 34 (lihat tabel). Meskipun tingkat ekspresi PF4 dalam leukosit cenderung lebih rendah daripada yang terlihat dalam MK, telah ditunjukkan bahwa ekspresi “ektopik” Cre pada tikus Pf4-Cre mengarah pada ablasi gen target di subpopulasi leukosit dan makrofag. 5 Oleh karena itu, ada kebutuhan untuk strain tikus deleter alternatif yang lebih spesifik menargetkan MK. Para penulis memilih gen Gp1ba karena sangat diekspresikan dalam MKs. 6

Perbandingan Pf4-Cre dan Gp1ba] Cre tikus

Para penulis memulai studi mereka dengan mengukur parameter hematologis pada tikus knock-in (KI) heterozigot (Gp1baCre+ / KI) dan menemukan mereka memiliki jumlah trombosit normal, tetapi sedikit peningkatan volume trombosit dan pengurangan GPIb-IX permukaan. Fungsi trombosit dipertahankan. Meskipun ringan, kelainan trombosit ini mungkin perlu diperhitungkan ketika mempelajari MK / ekspresi spesifik trombosit menggunakan sistem baru ini (lihat tabel).

Untuk menentukan apakah ekspresi Cre terbatas pada garis keturunan MK, keduanya Gp1baCre+ / KI dan Pf4-Cre+ / KI hewan disilangkan dengan tikus yang mengekspresikan membran target tandem dimer tomat (mT; tdTomato) dan protein berfluoresensi hijau (mT; EGFP) yang ditingkatkan sebelum rekombinasi yang dimediasi Cre. 7 Dalam 24 jam eksisi yang dimediasi Cre, sel yang terkena mulai mengekspresikan mT; EGFP, diikuti oleh semakin banyak hilangnya fluoresensi tdTomat secara bertahap. Para penulis memantau timbulnya ekspresi EGFP dan hilangnya ekspresi tdTomato untuk mendapatkan wawasan tentang waktu ekspresi Cre dalam populasi seluler yang berbeda. Dalam kedua tikus Gp1baCre dan Pf4-Cre tikus, pemeriksaan darah tepi mengungkapkan bahwa rekombinasi yang dimediasi Cre terjadi di hampir semua trombosit dan hampir tidak ada sel darah merah. . Yang penting, di sumsum tulang (BM), ∼95% dari MK adalah EGFP + pada tikus Pf4-Crehanya 74% dari MK di Gp1baCre tikus adalah EGFP +menunjukkan ablasi gen lebih efisien pada tikus Cre Pf4- dibandingkan dengan tikus Gp1ba-Cre . Ekspresi Leukocyte-EGFP sangat berbeda antara 2: ∼2% dari CD45 + sel dalam Gp1baCre tikus positif dibandingkan dengan ∼26% dari CD45 + sel pada tikus Pf4-Cre. Perbedaan ini juga terlihat pada garis keturunan myeloid / limfoid lainnya, menunjukkan bahwa Cre recombinase diekspresikan dalam berbagai sel putih dalam sistem Pf4-Cre (lihat tabel ).

Perbedaan antara kedua konstruk ini memengaruhi fenotip tikus KO kondisional yang dihasilkan ketika Gp1baCre atau tikus Pf4-Cre disilangkan dengan hewan yang tergenang. Misalnya, dalam studi dengan KO bersyarat Csk dan CD148, dibandingkan dengan Gp1batikus Cretikus Pf4-Cre memiliki kadar Csk dalam trombosit yang lebih rendah, dan trombositopenia yang lebih parah dan peningkatan volume trombosit yang lebih besar. Di sisi lain, meskipun Cskfl / fl; Gp1baCre+ / KI tikus memiliki jumlah sel darah putih normal, mereka secara signifikan meningkat pada Cskfl / fl; PF4-Cre + / KI tikus, kemungkinan sebagai konsekuensi dari penghapusan gen pada limfosit. Demikian pula, KO bersyarat dari Shp1 yang dihasilkan pada Gp1baCre latar belakangnya sehat, sedangkan hewan pada latar belakang Pf4-Cre mengembangkan fenotipe inflamasi yang mirip dengan motheaten, kemungkinan disebabkan oleh ablasi gen pada leukosit.

Meskipun artikel tersebut menggambarkan model baru untuk menghasilkan KO spesifik MK, artikel ini juga memberikan wawasan baru yang potensial ke dalam biologi PF4 dan GPIbα. Ekspresi Cre yang digerakkan PF4 terjadi secara luas di luar garis silsilah MK, meskipun jumlah relatif ekspresi PF4 dalam himpunan bagian leukosit vs MKs perlu dieksplorasi. Implikasi dari penelitian ini terhadap biologi PF4 harus dilihat dengan hati-hati karena faktor-faktor lain selain kekhususan ekspresi Cre mungkin berkontribusi pada perbedaan yang diamati antara Pf4-Cre dan GP1ba-Cre binatang. Berbeda dengan konstruk KI GP1ba-Cre yang tertanam dalam locus Gp1ba endogen, mouse Pf4-Cre dihasilkan menggunakan konstruk BAC di situs penyisipan yang tidak dikenal yang dapat mempengaruhi ekspresi dari lokus Cxcl4. Selain itu, mouse Pf4-Cre mengandung 4 gen kemokin CXC tambahan yang dapat mengubah biologi leukosit 2 dan memodifikasi ekspresi PF4 (lihat tabel).

The penulis juga menyimpulkan bahwa PF4 diekspresikan lebih awal dari GPIbα pada megakaryopoiesis. Kesimpulan ini harus diperlunak oleh diskusi di atas mengenai perbedaan dalam konstruksi KI dan oleh Cre yang digerakkan oleh BAC PF4 yang diekspresikan lebih kuat, yang mengarah pada sinyal EGFP yang lebih cerah dan kepunahan tomat yang lebih efisien. Selain itu, ekspresi Cre-recombinase terjadi ketika MK sedang mengalami perubahan poliploidi. Cre yang digerakkan oleh PF4 yang lebih kuat mungkin dapat mengefisienkan KO banyak salinan gen dalam MK poliploid yang matang, sedangkan promotor Gp1ba mungkin tidak dapat menonaktifkan semua salinan. [19659029] Singkatnya, Nagy dkk melaporkan wawasan baru yang penting ke dalam PF4 dan Gp1ba -didorong pola ekspresi Cre dalam hematopoiesis, mendukung bahwa PF4 cukup diekspresikan dalam garis keturunan non-MK untuk mempengaruhi fenotipe KO. Kesimpulan tentang ekspresi fisiologis PF4 perlu diperhalus oleh keterlibatan Pf4-Cre dalam BAC KI. Gp1baCre menyatakan Cre selama megakaryopoiesis pada efisiensi yang lebih rendah, tetapi dengan lebih sedikit efek off-target hematopoietik. Tikus Gp1baCre+ / KI hanya memiliki gen tunggal Gp1bayang mengarah ke makrothrombositopenia ringan yang mungkin mewarnai beberapa studi MK / trombosit . Jadi, sebagaimana diuraikan (lihat tabel), setiap konstruk memiliki kelebihan dan kekurangannya. Memahami keterbatasan kedua sistem sangat penting untuk menafsirkan hasil dalam studi KO khusus MK. Keterbatasan dalam model ini tidak tumpang tindih. Studi bersamaan dengan 2 sistem deleter dapat meningkatkan wawasan tentang biologi trombosit.

Download Jurnal Disini

Tags: