Jurnal Internasional Glutamin melalui α-ketoglutarate dehidrogenase memberikan succinyl-CoA untuk sintesis heme selama eritropoiesis

Download Jurnal Disini

Poin Utama

  • Selama akhir erythropoiesis, glutamin eksogen, daripada intermediet siklus TCA, memberikan karbon untuk succinyl-CoA untuk sintesis heme.

  • Itaconate, senyawa yang diproduksi sebagai bagian dari respon inflamasi, menghambat sintesis heme dalam sel-sel yang mengalami erythropoiesis.

Visual Abstrak

Abstrak

Selama diferensiasi eritroid, eritron harus merombak konstituen proteinnya sehingga sel merah matang mengandung hemoglobin sebagai komponen protein sitoplasma utama. . Untuk ini, molekul of10 9 heme harus disintesis, mengkonsumsi 10 10 molekul succinyl-CoA. Telah lama diasumsikan bahwa sumber succinyl-coenzyme A (CoA) untuk sintesis heme pada semua tipe sel adalah siklus asam tricarboxylic (TCA). Berdasarkan pengamatan bahwa 1 subunit dari suksinil-CoA sintetase (SCS) secara fisik berinteraksi dengan enzim pertama sintesis heme (5-aminolevulinate synthase 2, ALAS2) dalam sel eritroid, telah diasumsikan bahwa succinyl-CoA untuk sintesis ALA disediakan. oleh adenosin triphosphate-dependent reverse SCS reaction. Kami sekarang telah menunjukkan bahwa ini bukan cara yang mengembangkan sel-sel eritroid memberikan succinyl-CoA untuk sintesis ALA. Sebaliknya, selama tahap akhir erythropoiesis, metabolisme sel diremajakan sehingga glutamin adalah prekursor untuk ALA setelah deaminasi ke α-ketoglutarat dan konversi menjadi suksinil-CoA oleh α-ketoglutarat dehidrogenase (KDH) tanpa ekuilibrasi atau melalui siklus TCA. Ini mungkin difasilitasi oleh interaksi langsung antara ALAS2 dan KDH. Suksinat bukan prekursor yang efektif untuk heme, menunjukkan bahwa reaksi balik SCS tidak berperan dalam menyediakan succinyl-CoA untuk sintesis heme. Penghambatan dehidrogenase suksinat oleh itaconate, yang telah ditunjukkan dalam makrofag untuk secara dramatis meningkatkan konsentrasi suksinat intraseluler, tidak merangsang sintesis heme seperti yang diantisipasi, tetapi sebenarnya menghambat hemoglobinisasi selama eritropoiesis akhir.

Pendahuluan

Kemampuan sel untuk mempertahankan kadar metabolit kunci yang sesuai dalam menanggapi perubahan tuntutan organisme dan lingkungan sangat penting untuk kelangsungan hidup dan pertumbuhan. Pemantauan dan pemahaman skema pengaturan merupakan tantangan, tetapi penting jika seseorang memahami dasar metabolisme untuk penyakit serta dampak potensial dari xenobiotik pada metabolisme seluler. Semua jenis sel memiliki kebutuhan metabolisme dan peraturan mereka sendiri, tetapi mereka yang menjalani diferensiasi menjadi tipe sel baru menghadirkan tantangan unik. Ini jelas benar untuk sel-sel yang mengalami erythropoiesis di mana, dimulai dengan sel induk hematopoietik (HSC), setiap pembelahan sel menghasilkan sel anak yang berbeda dari induknya. 12 Menambah kompleksitas untuk keseluruhan proses adalah bahwa erythropoiesis terjadi di dalam sumsum tulang di pulau erythroblastic di mana prekursor sel merah ada dalam hubungan erat dengan makrofag perawat. 34

Salah satu peristiwa ciri diferensiasi erythroid terminal adalah induksi terkoordinasi sintesis heme dan globin. Onset sintesis heme terjadi ketika enzim jalur pertama, erythroid-spesifik 5-aminolevulinate synthase (ALAS2), diinduksi. 5 Pada manusia, ini terjadi pada eritroblast basofilik, mencapai maksimum dalam polikromatik / erythroblast ortokromatik, sedangkan pada sistem murine induksi awal terjadi lebih awal, dalam proerythroblast. 6 Diferensiasi diferensiasi eritroid yang dihasilkan menghasilkan upregulasi sintesis heme dengan induksi ALAS2, peningkatan transkripsi semua enzim jalur heme gen, 57 dan fosforilasi dari enzim jalur terminal, ferrochelatase (FECH). 8 Selain regulasi transkripsi, ALAS2 juga tunduk pada regulasi translasi oleh besi melalui besi-regulator protein / besi-responsif elemen mesin 9 12 dan microRNAs. 13 [19659014] Modifikasi posttranslational protein melalui penambahan pyridoxal fosfat kofaktor sangat penting.14 Hidroksilasi ALAS2 menurunkan aktivitas ALAS2 dan mendestabilisasi untuk degradasi proteasom, 15 dan translokasi posttranslational dari ALAS ke mitokondria dihambat oleh pengikatan heme ke bentuk prekursor sitoplasma dari ALAS. 1618

Sintesis heme dalam sel metazoan membutuhkan zat besi, glisin, dan succinyl-coenzyme A (CoA) (tambahan Gambar 1, tersedia di situs web Darah). 219 Pasokan zat besi untuk heme baik dalam kegiatan rumah tangga dan selama diferensiasi eritroid telah dipelajari dengan baik, dan pandangan yang wajar dari komponen yang terlibat dalam proses ini baik pada tingkat organisme dan sel ada. 20 Glycine melimpah dalam plasma (∼250 µM), dan studi tentang glyci transporter ne konsisten dengan glisin yang dipasok dari sumber ekstraseluler. 2123 Sebaliknya, pengetahuan kita tentang bagaimana succinyl-CoA disediakan untuk sintesis heme selama diferensiasi eritroid adalah tidak dipahami dengan baik. Asumsi bahwa siklus asam tricarboxylic (TCA) mensuplai succinyl-CoA untuk sintesis erythroid heme telah dibuat, tetapi ada kekurangan data untuk mendukung pandangan ini. Ada kemungkinan bahwa untuk sel-sel non-eritroid, di mana hanya sedikit tingkat heme yang disintesis, terdapat kapasitas yang cukup dari siklus TCA untuk mensuplai succinyl-CoA. 24 Namun, membangkitkan mekanisme ini untuk sel eritroid akan secara jelas menempatkan sel-sel di bawah tekanan karena setiap molekul heme yang dihasilkan membutuhkan 8 molekul succinyl-CoA, dan sel membuat molekul heme 1,2 × 10 9 dalam rentang 2 hingga 3 hari. Telah ditunjukkan bahwa ALAS2, tetapi tidak housekeeping ALAS (ALAS1), secara fisik berinteraksi dengan adenosine triphosphate (ATP) -sependent succinyl-CoA synthetase (SCS) β-subunit SUCLA2. 2526 Karena ALAS2 menggunakan succinyl-CoA untuk mensintesis ALA, dan karena SUCLA2 sebagai subunit SCS dapat dilibatkan dalam reaksi reverse SCP yang bergantung ATP untuk menghasilkan succinyl-CoA dari suksinat, satu hipotesis yang diteruskan adalah bahwa ALAS2- Interaksi SUCLA2 ada untuk memberikan succinyl-CoA untuk sintesis ALA selama eritropoiesis. Namun, meskipun jelas bahwa hubungan antara ALAS2 dan SUCLA2 dapat ada, tidak ada data yang tersedia untuk menunjukkan peran apa, jika ada, interaksi ini bermain dalam suplai succinyl-CoA untuk ALAS2.

Data yang dikumpulkan dalam arus bekerja dari sel-sel yang menjalani diferensiasi erythroid in vitro menunjukkan bahwa succinyl-CoA untuk sintesis ALA tidak muncul dari suksinat siklus TCA, tetapi dari α-ketoglutarat (KG) yang berasal dari glutamin dan bahwa selama metabolisme sel erythropoiesis akhir diremajakan sehingga utama peran glutamin adalah untuk melayani sebagai prekursor untuk sintesis heme. Ini memiliki implikasi signifikan terhadap pemahaman kita tentang metabolisme sel selama eritropoiesis. Menariknya, kami menemukan bahwa itaconate, senyawa yang diproduksi dan diekskresikan oleh makrofag yang diinduksi lipopolisakarida, 27 yang diketahui menyebabkan peningkatan kadar suksinat sell dengan menghambat suksinat dehidrogenase (SDH), 27 [19659058] ⇓29 menghambat sintesis heme dan diferensiasi eritroid dan bahwa penghambatan ini dibalik oleh ALA yang diberikan secara eksogen. Peran fisiologis untuk itakata yang dihasilkan makrofag selama eritropoiesis belum teridentifikasi, tetapi data yang disajikan di sini menunjukkan bahwa ia menghambat sintesis ALA dengan cara yang belum teridentifikasi.

Metode

13 Pelabelan C, ekstraksi sel, dan Karakterisasi kromatografi cair – mass spectrometry (LC / MS) sel murine erythroleukemia (MEL) yang mengalami diferensiasi eritroid dijelaskan dalam bahan tambahan. Pengujian enzim siklus TCA dilakukan dengan mitokondria yang diisolasi dari sel-sel MEL yang berbeda seperti yang dijelaskan dalam bahan tambahan. CD34 + sel diperluas dan dibedakan mengikuti protokol StemCell (StemCell Technologies Inc). Detail tambahan ada di bahan tambahan. Flow cytometry dilakukan di University of Utah Flow Cytometry Facility.

Hasil

Nasib dari 13 prekursor heme metabolik C-label selama diferensiasi eritroid

Protoheme IX memiliki total 34 karbon dengan 26 dari ini berasal dari succinyl-CoA dan 8 karbon berasal dari glisin (Gambar 1B-C). Dengan asumsi bahwa glisin untuk sintesis heme diberikan secara eksogen, 2223 maka 76% heme karbon berasal dari sumber yang menghasilkan succinyl-CoA (Gambar 1A ). Selama eritropoiesis akhir, peningkatan sintesis heme menciptakan permintaan Succinyl-CoA yang meningkat secara signifikan yang diyakini berasal dari siklus TCA. Pengeringan siklus ini akan membutuhkan pengisian ulang melalui suplementasi anaplerotik. 30 Baik glukosa dan glutamin dapat mengisi siklus TCA dengan konversi piruvat menjadi oksaloasetat dan glutamat menjadi α-KG, masing-masing. Untuk menentukan apakah salah satu dari reaksi anaplerotik ini menyediakan karbon untuk sintesis heme selama erythropoiesis, kami menggunakan prekursor seragam (U) berlabel 13 C dan mengikuti penggabungan mereka ke dalam heme dalam membedakan sel MEL melalui LC / MS. Sel-sel MEL diinduksi untuk membedakan, dan untuk periode 24-jam antara 48 dan 72 jam pascainduksi, waktu sintesis heme maksimal dalam sistem ini, media dilengkapi dengan U- 13 C-label (1 Glukosa, (2) glutamin, atau (3) dietilSinatin (DES), analog suksinat sel-permeabel yang biasa digunakan. 31 Heme diekstraksi dan diisolasi dari sel pada postinduksi 72 jam sebelum analisis oleh LC / MS. Sebuah jendela paparan 24 jam ke U- 13 C-label metabolit dipilih dalam upaya untuk meminimalkan perombakan sel label.

Pola pelabelan ALA oleh suksinat atau glukosa melalui siklus TCA atau glutamin. (A) Siklus TCA ditunjukkan dengan karbon warna senyawa antara yang dikodekan ke sumber aslinya. Karbon yang berasal dari glukosa melalui asetil-CoA berwarna hitam. Karbon ini menjadi 2 karbon distal dari gugus amino ALA. Karbon dari succinate yang disediakan secara eksogen yang memindahkan siklus TCA sekali berwarna merah dan menjadi 2 karbon yang berdekatan dengan karbon (amino) yang diturunkan glikin dan gugus amino ALA. Suksinat yang secara langsung diubah menjadi succinyl-CoA oleh reaksi reverse SCS yang bergantung ATP berwarna kuning. Semua 4 karbon suksinat yang masuk dengan cara ini dimasukkan ke dalam ALA. Karbon glutamin diberi label dengan warna biru. Setelah dekarboksilasi ke α-KG, semua 4 atom dimasukkan ke ALA. Jika karbon ini melewati siklus TCA, mereka akan memberi label ALA seperti yang ditunjukkan dengan warna merah untuk suksinat. (B-C) Model bola dan tongkat protoporfirin heme IX diperlihatkan. Pada kedua panel, atom karbon yang berasal dari glisin berwarna hijau. (B) Karbon yang berasal dari glukosa melalui siklus TCA seperti yang ditunjukkan pada panel A berwarna hitam. Karena dekarboksilasi selama sintesis porfirin, hanya 10 karbon yang diturunkan glukosa dapat berkontribusi pada heme akhir, sedangkan hingga 16 karbon dari molekul suksinat yang mentransmisikan siklus (merah) berpotensi berakhir dalam heme. (C) Karbon yang berasal dari glutamin berwarna biru. Perlu dicatat bahwa jika suksinat secara langsung diubah menjadi succinyl-CoA oleh reaksi reverse SCS yang digerakkan ATP, maka pola pelabelannya akan identik dengan apa yang diperlihatkan untuk karbon yang berasal dari glutamin.

“data-icon-position = “” data-hide-link-title = “0”>  Gambar 1.

Gambar 1 .

Pola pelabelan ALA oleh suksinat atau glukosa melalui siklus TCA atau glutamin. (A) Siklus TCA ditunjukkan dengan karbon warna senyawa antara yang dikodekan ke sumber aslinya. Karbon berasal dari glukosa melalui asetil- CoA berwarna hitam, karbon ini menjadi 2 karbon distal dari gugus amino ALA, karbon dari succinate yang disediakan secara eksogen yang transit siklus TCA sekali berwarna merah dan menjadi 2 karbon yang bersebelahan dengan glycine-derived (hijau) karbon dan gugus amino ALA, suksinat yang secara langsung diubah menjadi succinyl-CoA oleh rejeksi terbalik SCS yang bergantung ATP n berwarna kuning. Semua 4 karbon suksinat yang masuk dengan cara ini dimasukkan ke dalam ALA. Karbon glutamin diberi label dengan warna biru. Setelah dekarboksilasi ke α-KG, semua 4 atom dimasukkan ke ALA. Jika karbon ini melewati siklus TCA, mereka akan memberi label ALA seperti yang ditunjukkan dengan warna merah untuk suksinat. (B-C) Model bola dan tongkat protoporfirin heme IX diperlihatkan. Pada kedua panel, atom karbon yang berasal dari glisin berwarna hijau. (B) Karbon yang berasal dari glukosa melalui siklus TCA seperti yang ditunjukkan pada panel A berwarna hitam. Karena dekarboksilasi selama sintesis porfirin, hanya 10 karbon yang diturunkan glukosa dapat berkontribusi pada heme akhir, sedangkan hingga 16 karbon dari molekul suksinat yang mentransmisikan siklus (merah) berpotensi berakhir dalam heme. (C) Karbon yang berasal dari glutamin berwarna biru. Perlu dicatat bahwa jika suksinat secara langsung diubah menjadi succinyl-CoA oleh reaksi reverse SCS yang digerakkan ATP, maka pola pelabelannya akan identik dengan apa yang diperlihatkan untuk karbon yang berasal glutamin.

Data yang diperoleh mengungkapkan bahwa 2,5% dari heme karbon diberi label ketika U- 13 C DES adalah satu-satunya sumber label isotop, sedangkan 8,3% diberi label dengan glukosa U- 13 C dan 23% dari heme karbon diberi label oleh U- 13 C glutamine. Karena jumlah heme yang disintesis dalam 48 jam pertama pascainduksi tidak tunduk pada pelabelan, percobaan paralel di mana sintesis heme dihambat pada 48 jam oleh inhibitor aminolevulinate dehidratase (porphobilinogen synthase) succinylacetone 32 dilakukan. Ini menunjukkan bahwa 30% dari hadir heme pada 72 jam disintesis sebelum periode 24-jam 13 C-pelabelan percobaan. Dengan demikian, total U- 13 C-berlabel DES, glukosa, dan kontribusi glutamin adalah 3,6, 12,0, dan 33,0%, masing-masing.

Data isotopomer menunjukkan bahwa suksinat diberikan sebagai U- 13 C DES memberikan label yang signifikan dalam protoporphyrin hanya hingga total 5 karbon (M + 5) dengan kontribusi terbesar di atas tingkat latar belakang menjadi M + 2, M + 3, dan M + 4 (Gambar 2A). Titik-titik data ini menunjukkan bahwa suksinat tidak secara langsung diubah menjadi succinyl-CoA oleh reverse SCS dan juga merupakan sumber karbon yang buruk untuk ALAS2 bahkan setelah melewati siklus TCA. U- 13 C dari glukosa memiliki tingkat pelabelan tertinggi sekitar M + 8 dan memberikan label di atas latar belakang mendekati M + 16 (Gambar 2B). Pelabelan yang signifikan terlihat serendah M + 2 tetapi tidak setinggi M + 18. Titik-titik data ini menunjukkan bahwa kontribusi keseluruhan glukosa untuk sintesis heme seluler selama erythropoiesis (12%) adalah minor. Glutamin-disediakan U- 13 C mengakibatkan heme dengan penggabungan maksimum sekitar M + 13 dan label yang signifikan hingga M + 23 (Gambar 2C). Tidak ada pelabelan signifikan di bawah M + 4. Titik-titik data ini menunjukkan bahwa glutamin adalah prekursor unggul succinyl-CoA untuk ALAS2 daripada glukosa atau suksinat dan digunakan secara langsung daripada melewati siklus TCA (lihat bahan tambahan). Data isotopomer menunjukkan bahwa tidak ada senyawa tunggal dalam sel selama erythropoiesis adalah satu-satunya sumber karbon untuk succinyl-CoA yang digunakan oleh ALAS2. Namun, jelas bahwa glutamin adalah yang paling efektif dan memainkan peran penting selama peningkatan sintesis heme.

Pelabelan isotop heme dan berbagai macam metabolit oleh 13C diethyl suksinat, 13C glukosa atau 13C glutamine, menunjukkan bahwa glutamin sangat digunakan sebagai prekursor untuk heme tetapi suksinat tidak. (A-C) Grafik batang menunjukkan pelabelan heme yang ditentukan secara eksperimen, diisolasi dari diferensiasi sel MEL setelah pengobatan dengan metabolit berlabel yang ditunjukkan dan menunjukkan distribusi 13 C-disediakan massa (“M”) untuk hemes terisolasi. Dalam gambar-gambar ini, M mewakili heme yang terdeteksi tanpa 13 C dimasukkan ke dalam 34 karbon heme (karbon semua 12 C): M + 1 adalah heme dengan 1 atom 13 C dimasukkan; M + 2 adalah heme dengan 2 13 C karbon, dll. Batang hijau mewakili nilai kontrol dari sampel yang diperlakukan dengan metabolit tak berlabel dan menunjukkan distribusi alami penggabungan 13 C. (A) Sumber 13 C adalah suksinat seperti yang disediakan oleh DES (bar kuning). Karbon yang berasal dari DES hanya sedikit digunakan dalam biosintesis heme. (B) Sumber label C 13 adalah glukosa (batang hitam). Grafik batang menunjukkan bahwa beberapa karbon dari glukosa berlabel dimasukkan ke dalam heme. (C) Sumber 13 C adalah glutamin (batang biru), yang diubah menjadi α-KG oleh deaminasi sebelum sintesis yang digerakkan oleh KDH dari succinyl-CoA untuk sintesis ALA. Glutamin ditampilkan di sini untuk menjadi prekursor unggul untuk biosintesis heme, dan hemes terisolasi ditemukan mengandung hingga 23 atom karbon yang berasal dari glutamin berlabel. (D) Distribusi label yang berasal dari 13 C glukosa, 13 C glutamin, dan 15 N glutamin menjadi glutamin dan glutamat ditampilkan. (E) Distribusi label yang berasal dari 13 C glukosa, 13 C glutamine, dan 15 N glutamin ke dalam siklus TCA intermediet malat dan fumarat ditampilkan. (F) Distribusi label yang berasal dari 13 C glukosa, 13 C glutamine, dan 15 N glutamin ke prolin ditampilkan. Setiap percobaan pelabelan dilakukan dalam rangkap tiga.

“data-icon-position =” “data-hide-link-title =” 0 “>  Gambar 2.

Gambar 2.

Pelabelan isotop heme dan berbagai macam metabolit oleh 13C diethyl suksinat, 13C glukosa atau 13C glutamine, menunjukkan bahwa glutamin sangat digunakan sebagai prekursor untuk heme tetapi suksinat tidak. (AC) Grafik batang menunjukkan pelabelan heme yang ditentukan secara eksperimen, diisolasi dari sel MEL yang berbeda setelah pengobatan. dengan metabolit berlabel diindikasikan dan menunjukkan distribusi 13 C-disediakan massa (“M”) untuk hemes terisolasi. Dalam angka-angka ini, M mewakili heme terdeteksi tanpa 13 C dimasukkan ke dalam 34 karbon heme (karbon semuanya 12 C): M + 1 adalah heme dengan 1 atom 13 C dimasukkan; M + 2 adalah heme dengan 2 13 C karbon, dll. Batang hijau mewakili nilai kontrol dari sampel yang diperlakukan dengan metabolit taklabel dan menunjukkan distribusi alami penggabungan 13 C. (A) Sumber 13 C adalah suksinat seperti yang disediakan oleh DES (bar kuning). Karbon yang berasal dari DES hanya sedikit digunakan dalam biosintesis heme. (B) Sumber label C 13 adalah glukosa (batang hitam). Grafik batang menunjukkan bahwa beberapa karbon dari glukosa berlabel dimasukkan ke dalam heme. (C) Sumber 13 C adalah glutamin (batang biru), yang diubah menjadi α-KG oleh deaminasi sebelum sintesis yang digerakkan oleh KDH dari succinyl-CoA untuk sintesis ALA. Glutamin ditampilkan di sini untuk menjadi prekursor unggul untuk biosintesis heme, dan hemes terisolasi ditemukan mengandung hingga 23 atom karbon yang berasal dari glutamin berlabel. (D) Distribusi label yang berasal dari 13 C glukosa, 13 C glutamin, dan 15 N glutamin menjadi glutamin dan glutamat ditampilkan. (E) Distribusi label yang berasal dari 13 C glukosa, 13 C glutamine, dan 15 N glutamin ke dalam siklus TCA intermediet malat dan fumarat ditampilkan. (F) Distribusi label yang berasal dari 13 C glukosa, 13 C glutamine, dan 15 N glutamin ke prolin ditampilkan. Setiap percobaan pelabelan dilakukan dalam rangkap tiga.

Menyadari bahwa glukosa dapat dimetabolisme menjadi glutamat dan bahwa ini dapat menyebabkan pengenceran jelas label glutamin masuk ke heme selama erythropoiesis, kami memeriksa jumlah glutamin dan glutamat dalam sel yang dihasilkan dari U- 13 C berlabel glukosa selama periode eksperimental (Gambar 2D). Data menunjukkan bahwa glukosa menyumbang ∼10% untuk glutamat seluler dan kolam glutamin pada tingkat M + 2 bahkan ketika glutamin yang dipasok sedang tersedia. Agaknya ini hasil dari transaminasi TCA siklus-berasal α-KG. Dengan demikian, data berbasis isotopomer untuk heme karbon yang berasal dari glutamin mewakili perkiraan yang kurang, karena ketersediaan kolam glutamin C U-13 secara signifikan diencerkan oleh glutamin tanpa label endogen.

Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 2Edalam membedakan sel MEL, glukosa diubah menjadi siklus TCA intermediet fumarat dan malat sebagai M + 2 dan M + 3 isotopomer lebih baik daripada glutamin. Ini konsisten dengan model kami, di mana glutamin secara istimewa diubah menjadi succinyl-CoA untuk digunakan oleh ALAS2 dan bukan untuk pengisian generik dari siklus TCA. Namun, glutamat adalah prekursor untuk prolin, dan ini terbukti dari 13 C- dan 15 N-glutamine pelabelan prolin dalam membedakan sel MEL (Gambar 2F ). Tidak mengherankan, dan sesuai dengan data kami yang disajikan di atas, glukosa juga menyumbangkan karbon untuk proline melalui TCA yang dihasilkan α-KG yang ditransaminasi ke glutamat untuk sintesis prolin selanjutnya.

Enzim siklus TCA selama erythropoiesis

Jika perubahan dalam fluks metabolit sentral terjadi setelah inisiasi erythropoiesis, orang mungkin mengharapkan perubahan yang sesuai dalam aktivitas enzim kunci. Jadi, jika succinyl-CoA untuk sintesis ALA dipasok oleh siklus TCA, akan ada peningkatan enzim siklus TCA. Sebaliknya, untuk model yang memiliki glutamin sebagai sumber utama karbon untuk ALA, akan diantisipasi bahwa akan ada peningkatan enzim α-ketoglutarate dehidrogenase (KDH), tetapi tidak harus peningkatan semua enzim siklus TCA lainnya. . KDH terdiri dari 3 jenis subunit: oksoglutarat dehidrogenase (E1), dihidrolipoamida S-succinyltransferase (E2), dan dihydrolipoamide dehidrogenase (E3). 3334 Pemeriksaan data di ErythronDB 3536 mengungkapkan bahwa selama tingkat mRNA eritropoiesis utusan definitif dewasa (mRNA) untuk subunit KDH E1 memiliki korelasi positif dengan enzim sintesis heme ALAS2 (0,92) dan FECH (0,90), yang keduanya menunjukkan peningkatan yang signifikan selama eritropoiesis. Namun, ALAS2 dan FECH memiliki korelasi negatif dengan banyak enzim siklus TCA (SDHB, −0.49; SUCLA2, −0.55; ACLY, −0.57; dan SDHD, −0.75), yang umumnya tetap konstan atau menurun. Menyadari bahwa tingkat mRNA mungkin tidak selalu secara akurat mencerminkan aktivitas enzim, kami mengukur aktivitas 6 enzim siklus TCA dalam sel MEL (Gambar 3A).

Only aconitase, isocitrate dehydrogenase, and KDH showed increases in cells undergoing erythroid differentiation relative to their activity in undifferentiated cells. Due to the significant increase in KDH enzyme activity as measured in vitro, further examination of KDH was warranted because it plays a central role in any model of heme synthesis. We verified that the ErythronDB mRNA increase of E1 was reflected in protein expression in differentiating MEL cells via western blot analysis (Figure 3B). There is a more than threefold increase in E1 protein. Thus, mRNA, protein, and enzyme activity measurements all demonstrate an increase in the E1 KDH subunit during erythropoiesis.

Because KDH can be a nucleating point for some TCA cycle enzymes,33 we wondered if it might interact with ALAS2. When purified, His-tagged, recombinant ALAS2 and untagged KDH purified from porcine hearts were mixed in solution and applied to a cobalt resin column, and the E1 component of KDH coeluted with ALAS2 (Figure 3C). This illustrates that in vitro the E1 component of KDH interacts with ALAS2.

In addition, in situ interactions between KDH and ALAS2 were probed with antibody pull-downs of mitochondria from differentiating MEL cells using flag-tagged ALAS2 as bait as described previously.37 These data points clearly demonstrated that ALAS2 interacts with the E1, E2, and E3 subunits of KDH (Table 1).

Table 1.

Affinity purification and MS results of ALAS2

Impact of itaconate

Factors that influence the cellular supply of succinyl-CoA during erythropoiesis could clearly have an impact on heme synthesis. Itaconate, which is produced from the TCA cycle intermediate cis-aconitate by the enzyme IRG1, has been shown to disrupt the TCA cycle by blocking SDH resulting in increased cellular succinate.2729,3840 Given that itaconate causes accumulation of intracellular succinate, it could be imagined that it might stimulate porphyrin synthesis by increasing the amount of succinyl-CoA available (from reverse ATP-dependent SCS activity). In differentiating MEL cells, we monitored heme synthesis during erythroid differentiation41 (Figure 3D). Our data demonstrated that addition of 2.5 mM itaconate to cultures of differentiating cells did not result in an increase in heme synthesis, but instead caused an arrest in hemoglobinization. Significantly, this block could be reversed by adding ALA to the culture. These results are consistent with the finding from the isotopomeric studies that succinate is not the main source of succinyl-CoA for heme synthesis during late erythropoiesis.

Impact of metabolic inhibitors on erythroid heme synthesis

In order to further probe the source of precursors of α-KG and succinyl-CoA for heme synthesis, the impact of inhibitors that target enzymes potentially required for the synthesis of succinyl-CoA was examined in cells undergoing erythropoiesis. Aminooxyacetic acid (AOA), a broad-spectrum inhibitor of pyridoxal phosphate–dependent transaminases, has been shown to block early erythroid differentiation of CD34+ HSCs.42 AOA blocks glutamine deamination and thus the eventual conversion of glutamine into α-KG.43 This block can be bypassed by the addition of dimethyl-α-ketoglutarate (DMK), a cell-permeable analog of α-KG, to culture medium. Given that our data support the hypothesis that glutamine serves as source of carbons for heme synthesis by way of α-KG, we tested whether AOA impairs late erythroid differentiation by blocking heme synthesis. To do this, we examined the level of heme (as hemoglobin) produced by differentiating MEL cells treated with AOA.

MEL cells were selected because they are transformed murine spleen red cell precursors that are arrested at the proerythroblast stage. Upon DMSO-induced differentiation, there is an induction of heme biosynthesis.44,45 Addition of AOA at the initiation of erythroid differentiation reduced hemoglobin content by 76% as compared with untreated cells (Figure 4A). The addition of either DMK or ALA to AOA-treated differentiating MEL cell cultures rescued hemoglobinization (Figure 4B), whereas supplementing cultures with DES did not. These data points are consistent with the proposal that succinyl-CoA for heme synthesis during erythropoiesis arises from α-KG, and not succinate from the TCA cycle.

Rescue of hemoglobinization in AOA treated differentiating MEL cells. ALA and DMK but not DES rescue hemoglobinization of AOA treated MEL cells at 72 hours. MEL cells were treated with AOA and/or metabolites at erythroid differentiation induction (A) and at 48 hours postinduction (B). Data shown are averages of 3 determinations. Error bars represent mean ± standard deviation. **P < .01. SA, succinylacetone.

” data-icon-position=”” data-hide-link-title=”0″>Figure 4.

Figure 4.

Rescue of hemoglobinization in AOA treated differentiating MEL cells. ALA and DMK but not DES rescue hemoglobinization of AOA treated MEL cells at 72 hours. MEL cells were treated with AOA and/or metabolites at erythroid differentiation induction (A) and at 48 hours postinduction (B). Data shown are averages of 3 determinations. Error bars represent mean ± standard deviation. **P < .01. SA, succinylacetone.

In addition to MEL cells, we also examined human CD34+ cells to differentiate between cellular needs for glutamine prior to and during hemoglobinization. Human CD34+ cells are primary cells that represent a population of HSCs. When induced toward erythroid differentiation, they first pass through several early stages of erythropoiesis before becoming heme synthesizing basophilic erythroblasts.46 We monitored early erythroid differentiation at day 6, prior to significant elevation of ALAS2 and FECH that occurs at day 7 (supplemental Figure 2), by following expression of the surface receptors CD36, CD71 (transferrin), and CD235a (glycophorin A) and determined the impact that addition of DMK, DES, nucleosides, and/or ALA had on the differentiating CD34+ cells (Figure 5A). As previously reported,42 we found that the AOA-inhibited early erythroid differentiation could be overcome by addition of DMK to the medium (Figure 5B). This inhibition was not overcome by individual additions of DES, ALA, or nucleosides. These data points are consistent with the acknowledged multiple roles of glutamine (via α-KG) in cells undergoing the early stages of erythropoiesis.

Erythroid differentiation of CD34+cells. (A) CD34+-enriched cells were induced to erythroid differentiation in the absence or presence of DMK, ALA, nucleosides, or AOA. (B) Cells were exposed to DMK, ALA, nucleosides, or DES in combination with AOA as indicated. After 6 days of differentiation and treatment in StemSpan media with erythroid expansion supplement, cells were collected and differentiation was assessed by flow cytometry detection of cell surface markers CD235a and CD71. Labels for each treatment type are shown at the top of the figures. For each treatment type, from top to bottom, graphs illustrate flow cytometric pseudocolor plots of cells stained using CD235a (x-axis) and CD71 (y-axis) antibodies, histograms of these cells stained for CD71, and histograms of these cells stained for CD235a. (C) Results from CD34+ cells that were grown for 6 days in StemSpan media with erythroid expansion supplement before the removal of defined growth factors/cytokines other than EPO as described in the text. Cellular heme levels are shown for cultures after 3 and 6 days in the presence of EPO with indicated compound. UN, untreated. The bar graph presents combined biological and technical replicates (n = 4-6), mean ± standard deviation.

” data-icon-position=”” data-hide-link-title=”0″>Figure6

Erythroid differentiation of CD34+cells. (A) CD34+-enriched cells were induced to erythroid differentiation in the absence or presence of DMK, ALA, nucleosides, or AOA. (B) Cells were exposed to DMK, ALA, nucleosides, or DES in combination with AOA as indicated. After 6 days of differentiation and treatment in StemSpan media with erythroid expansion supplement, cells were collected and differentiation was assessed by flow cytometry detection of cell surface markers CD235a and CD71. Labels for each treatment type are shown at the top of the figures. For each treatment type, from top to bottom, graphs illustrate flow cytometric pseudocolor plots of cells stained using CD235a (x-axis) and CD71 (y-axis) antibodies, histograms of these cells stained for CD71, and histograms of these cells stained for CD235a. (C) Results from CD34+ cells that were grown for 6 days in StemSpan media with erythroid expansion supplement before the removal of defined growth factors/cytokines other than EPO as described in the text. Cellular heme levels are shown for cultures after 3 and 6 days in the presence of EPO with indicated compound. UN, untreated. The bar graph presents combined biological and technical replicates (n = 4-6), mean ± standard deviation.

” data-icon-position=”” data-hide-link-title=”0″>Figure7

Figure 5.

Erythroid differentiation of CD34+cells. (A) CD34+-enriched cells were induced to erythroid differentiation in the absence or presence of DMK, ALA, nucleosides, or AOA. (B) Cells were exposed to DMK, ALA, nucleosides, or DES in combination with AOA as indicated. After 6 days of differentiation and treatment in StemSpan media with erythroid expansion supplement, cells were collected and differentiation was assessed by flow cytometry detection of cell surface markers CD235a and CD71. Labels for each treatment type are shown at the top of the figures. For each treatment type, from top to bottom, graphs illustrate flow cytometric pseudocolor plots of cells s tained using CD235a (x-axis) and CD71 (y-axis) antibodies, histograms of these cells stained for CD71, and histograms of these cells stained for CD235a. (C) Results from CD34+ cells that were grown for 6 days in StemSpan media with erythroid expansion supplement before the removal of defined growth factors/cytokines other than EPO as described in the text. Cellular heme levels are shown for cultures after 3 and 6 days in the presence of EPO with indicated compound. UN, untreated. The bar graph presents combined biological and technical replicates (n = 4-6), mean ± standard deviation.

For cells that are undergoing late erythropoiesis and beginning to hemoglobinize, we measured cellular heme content41 at days 3 and 6 following removal of cytokines/growth factors other than erythropoietin (EPO). For these cells, we found that AOA inhibited hemoglobinization and that this could be overcome by addition of DMK and ALA, but not DES, to the medium (Figure 5C; supplemental Figure 3). These data points indicate that a major role served by glutamine during hemoglobinization must be for heme synthesis because ALA alone overcame the AOA block during late stages of erythropoiesis. Interestingly, when media were supplemented with ALA, there was background fluorescence, likely due to the presence of unmetallated porphyrin, that was not seen in the DMK or DES supplemented samples.

Discussion

In going from a proerythroblast to mature erythrocyte, cells can repurpose amino acids from a wide variety of cytoplasmic proteins for synthesis of new globins chains, but each cell must provide ∼1010 molecules of succinyl-CoA and an equivalent amount of glycine for heme synthesis. Although plasma and mitochondrial membrane glycine transporters support the provisioning of glycine from the circulatory system during erythropoiesis,2123 significant stores of succinyl-CoA do not exist and so this must be provided endogenously in a coordinated, real-time fashion. It is conceivable that in nonerythroid cells the TCA cycle can supply succinyl-CoA without compromising other metabolic pathways. However, given the level of heme synthesis during erythropoiesis, it is implausible that the TCA cycle would be able to function without robust anplerosis to resupply intermediates.

Although there have been proposals for the TCA cycle SUCLA2-dependent reverse SCS supply of succinyl-CoA for ALAS2,25,26 there exist no experimental data to support this hypothesis, and a number of observations are not consistent with this model. First, early studies with the particulate fraction from anemic chicken reticulocytes showed that α-KG served more efficiently than succinate as a precursor for ALA synthesis.19,47 Second, from an overall carbon economy perspective, utilizing TCA cycle intermediates for ALA production would require large-scale replenishment of the TCA cycle via anaplerotic reactions, not to mention the energetic costs of running the SCS reaction backward to generate succinyl-CoA for heme. Third, mice heterozygous for SUCLA2 knockout48 and human patients with SUCLA2 deficiency (MIM ID #612073) exhibit no signs of anemia, which one would anticipate if the ALAS2-SUCLA2 interaction is essential for the supply of succinyl-CoA for heme synthesis. Fourth, mRNA expression profiling during erythropoiesis shows a negative correlation (−0.7) between SUCLA2 and ALAS2 gene expression.35,36 Fifth, ALAS2 variants that have decreased interactions with SUCLA2 do not exhibit a uniform impact on ALAS2 activity. Some mutations result in diminished ALAS2 activity causing sideroblastic anemia,25,26 whereas others result in increased ALAS2 activity causing X-linked protoporphyria.49 Finally, we have demonstrated that succinate provided to differentiating erythroid precursor cells is a poor source of carbons for ALA synthesis when compared with glutamine.

What role SUCLA2 plays is unclear at present. Because it binds to both ALAS2 and FECH,37 it could be that during early stages of differentiation it stabilizes the apoprotein forms of ALAS2, which requires pyridoxyl phosphate as a cofactor,50 and FECH, which requires the presence of a [2Fe2S] cluster.51 Another possibility is that by SUCLA2 binding to ALAS2 and FECH it may prevent assembly of functional ATP-dependent SCS and, thereby, reduce conversion of succinyl-CoA into succinate when ALAS2 levels are high.

Our isotopomer-based analysis clearly demonstrated that glutamine is the preferred source of carbon for protoporphyrin synthesis (Figure 2C). Experimentally we determined that 13C-glutamine labeled 30% of the eligible total carbons in heme.

However, liquid LC/MS analysis reveals that only about one-third of the glutamine in the cell after 24 hours of incubation contains 13C label and that glucose contributes ∼10% of the cellular glutamate and glutamine pools. With these factors taken into consideration, we estimate that the experimentally determined magnitude of carbon flux from glutamine into heme is low by at least a factor of 2. A model where ALA is derived from glutamine via KDH rather than from succinate via SCS (Figure 6) is consistent with both the data presented herein and the published clinical observation that deficiency in thiamine, a required cofactor for KDH, results in a sideroblastic anemia52,53 similar to that found in X-linked sideroblastic anemia caused by deficiency in ALAS2 activity.

Overview of cellular metabolism for heme synthesis during early and late erythropoiesis. A cartoon of a cell is shown where the plasma membrane is a heavy blue line, and the mitochondrial inner and outer membranes are red with intermembrane space in light pink. Plasma membrane transporters for glucose, glycine, and glutamine are orange; mitochondrial inner membrane transporters for glutamate, glycine, ALA, and pyruvate are green. The heme biosynthetic pathway is abbreviated as a dashed arrow, but is shown in its entirety in supplemental Figure 1. Heme, the end product, exits the mitochondrial matrix following its release from FECH, but the pathway for this is currently undetermined. The TCA cycle is in blue with the enzymes KDH and SCS see text) shown boxed in the figure. The site of inhibition by AOA is illustrated with a bold red X. Multiple glutamine transaminases exist within the cell, and all are inhibited by AOA. (A) Cellular metabolism for late erythropoiesis when large quantities of heme are necessary for hemoglobinization of the developing erythron. Inside the mitochondrion are shown the pathways of glutamate to ALA with KDH in complex with ALAS2 and the previously described heme metabolon (Heme Metab.)38 as a red pentagon. (B) Cellular metabolism during early erythropoiesis when heme for cellular functions is synthesized utilizing ALAS1. Under these conditions, the amounts of heme synthesized are relatively low, and the required succinyl-CoA can be provided by the TCA cycle.

” data-icon-position=”” data-hide-link-title=”0″>Figure 6.

Figure 6.

Overview of cellular metabolism for heme synthesis during early and late erythropoiesis. A cartoon of a cell is shown where the plasma membrane is a heavy blue line, and the mitochondrial inner and outer membranes are red with intermembrane space in light pink. Plasma membrane transporters for glucose, glycine, and glutamine are orange; mitochondrial inner membrane transporters for glutamate, glycine, ALA, and pyruvate are green. The heme biosynthetic pathway is abbreviated as a dashed arrow, but is shown in its entirety in supplemental Figure 1. Heme, the end product, exits the mitochondrial matrix following its release from FECH, but the pathway for this is currently undetermined. The TCA cycle is in blue with the enzymes KDH and SCS see text) shown boxed in the figure. The site of inhibition by AOA is illustrated with a bold red X. Multiple glutamine transaminases exist within the cell, and all are inhibited by AOA. (A) Cellular metabolism for late erythropoiesis when large quantities of heme are necessary for hemoglobinization of the developing erythron. Inside the mitochondrion are shown the pathways of glutamate to ALA with KDH in complex with ALAS2 and the previously described heme metabolon (Heme Metab.)38 as a red pentagon. (B) Cellular metabolism during early erythropoiesis when heme for cellular functions is synthesized utilizing ALAS1. Under these conditions, the amounts of heme synthesized are relatively low, and the required succinyl-CoA can be provided by the TCA cycle.

Our data are consistent with a separation of glutamine for heme synthesis from a general anaplerotic replenishment of the TCA cycle in that we show glucose contributes to the TCA cycle intermediates during erythropoiesis more effectively than glutamine.

A glucose-derived label is found in malate and fumarate at higher levels than glutamine-derived malate and fumarate. This, along with the observation that 13C label from exogenously supplied glucose is found in significant amounts in cellular glutamate (Figure 2D), suggests that glucose may make contributions to heme via the cellular glutamate pool.

One interesting observation was that exposure of differentiating erythroid cells to itaconate, which is produced and secreted by immunoactivated macrophages and has been shown to increase intracellular succinate levels,27,28 did not stimulate heme synthesis as might be anticipated if succinate is a precursor for ALA synthesis. Instead, it inhibited hemoglobinization of these cells. This inhibition was rescued by addition of ALA to the culture medium, demonstrating that the blockage in hemoglobinization caused by itaconate occurs by inhibiting the availability of a necessary precursor or by directly inhibiting ALA production. This observation that itaconate decreases hemoglobinization in the developing erythron may be evidence for a link between anemia of inflammation and heme production. Itaconate is produced from the TCA cycle intermediate aconitate by the enzyme IRG1 and Irg1 as 1 of the most highly upregulated genes in macrophages under proinflammatory conditions28,38 Activated macrophages, which are present in erythroblastic islands along with erythroid precursor cells,54,55 excrete high concentrations of itaconate into the surrounding milieu. Thus, the action of itaconate on heme synthesis bears a resemblance to the action of hepcidin on heme synthesis during chronic infection.56 Both hepcidin and itaconate are antimicrobial compounds produced during the inflammatory response, and both inhibit heme synthesis, hepcidin by regulating iron and itaconate by regulating porphyrin synthesis. Thus, these may represent complementary systems that not only regulate overall heme synthesis but also prevent the accumulation of 2 toxic compounds: protoporphyrin and iron.

Glucose and glutamine metabolism via KDH have been shown to be essential for erythroid lineage commitment of CD34+ HSCs.43 Because glutamine is the most abundant amino acid in plasma, and plasma glucose levels in a healthy person range from 4 to 6 mM, both metabolites are readily available to developing erythroblasts. Knockdown of the glucose transporter Glut1 or the glutamine transporter ASCT2 in CD34+ stem cells decreased erythroid differentiation as measured by erythroid lineage-specific surface antigens. Oburoglu et al42 reported that glutamine is essential for nucleotide biosynthesis during erythropoiesis. Their conclusion that glutamine is required for nucleotide synthesis was based upon nucleoside rescue of CD34+ cells treated with 6-diazo-5-oxo-l-norleucine (DON). DON is a known inhibitor of glutamine utilizing enzymes, such as carbamoyl phosphate synthase, CTP synthase, NAD synthase, guanosine monophosphate synthetase, glutamine phosphoribosylpyrophosphate amidotransferase, formylglycinamide ribonucleotide amidotransferase, and asparagine synthase, which can all directly block nucleotide synthesis.57 This is aside from its ability to function as a glutaminase inhibitor. Because of DON’s targeted role in transaminase-independent inhibition of nucleotide synthesis, we focused on inhibition by AOA, which is more restricted to transaminases and not downstream pathways. Interestingly, we found that AOA inhibition of early erythropoiesis of CD34+ cells was not reversed by addition of nucleosides to the medium. Likewise, unlike DMK, ALA addition either alone or with nucleosides did not rescue the appearance of cell surface markers of erythroid maturation in CD34+ cell during early erythropoiesis. These data points demonstrate that glutamine plays a much greater role during early erythropoiesis than simply as a precursor to heme and nucleotide synthesis. The fact that either DMK or ALA rescues the AOA-mediated block of hemoglobinization in MEL cells and late-stage CD34+ cells supports an essential role for α-KG in hemoglobinization during late erythropoiesis. Glucose, which was present in all culture media, and DES did not rescue hemoglobinization in these cells, supporting the fact that their contributions alone to the production of succinyl-CoA via the TCA cycle are insufficient to support heme synthesis during erythropoiesis. However, it is clear from the 13C labeling, enzyme activity, cell culture data, and identification of the interaction between KDH and ALAS2 that KDH, in addition to being a component of the TCA cycle, serves a critical “moonlighting” role as primary supplier to succinyl-CoA for heme synthesis during erythropoietic hemoglobinization.

Acknowledgments

The authors gratefully acknowledge Tamara A. Dailey (deceased) for outstanding editorial assistance and critical discussions.

This work was supported by National Institutes of Health, National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases grants DK111653 (A.E.M.), U54 DK110858, DK090257 (J.D.P.), DK096501 (H.A.D.), NIH Office of the Director grant S10 OD016232 (J.C.) and by the University of Utah Flow Cytometry Facility in addition to the National Institutes of Health, National Cancer Institute through Award Number 5P30CA042014-24. Research reported in this publication was supported by the National Center for Research Resources of the National Institutes of Health under Award Number 1S10RR026802-01.

Authorship

Contribution: J.S.B. designed experiments, analyzed data and wrote the paper; J.R.M., J.A.M., and L.K.J. performed research and analyzed data; J.E.C., A.E.M., and J.D.P. analyzed data and edited the paper; and H.A.D. designed experiments, analyzed data, and wrote the paper.

Conflict-of-interest disclosure: The authors declare no competing financial interests.

Correspondence: Harry A Dailey Jr, Department of Microbiology, 230 Coverdell Center, University of Georgia, Athens, GA 30602; e-mail: hdailey{at}uga.edu.

Footnotes

  • The online version of this article contains a data supplement.

  • The publication costs of this article were defrayed in part by page charge payment. Therefore, and solely to indicate this fact, this article is hereby marked “advertisement” in accordance with 18 USC section 1734.

  • SubmittedJanuary 23, 2018.
  • AcceptedJuly 2, 2018.

Download Jurnal Disini

Tags: